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Erstellung fortschrittlicher Fluoreszenzsysteme zur Messung der Biomasse, Physiologie und Fotosynthese von Plankton im Labor und im Ozean

1. Forschungszwecke und Inhalte

Forschungsziele

Ziel des Projekts ist es, ein kleines Desktop-Instrument namens F-Fluoreszenz-I-Induktion und R-Prep-System (mini-FIRe) für die Analyse diskreter Proben und die kontinuierliche Messung der Fülle und des physiologischen Zustands des Planktons in den Ozeanen zu bauen. Im Gegensatz zu den von dem Rutgers-Team erfundenen und entwickelten Vorgängergenerationen von FRRF- und FIRe-Fluoreszenzgeräten wird das neue Instrument eine erhöhte Empfindlichkeit (etwa das Zehnfache) zeigen und mehr physiologische Parameter in Echtzeit liefern. Das neue InstrumenthochDie Empfindlichkeit macht sie von großem Wert für die Feldarbeit auf offener See.

Forschungsinhalte

Beurteilung der photosynthetischen Aktivität von Plankton und anderen fotosynthetischen Organismen mit variabler Fluoreszenztechnik- Die schnelle und beschädigungsfreie Bewertung des physiologischen Zustands von fotosynthetischen Organismen basiert auf der Verwendung von Rapid Repetitive Frequency Fluorescence (FRRF) und ihrer Technologie der Folge-Fluoreszenz-Induktion und Entspannung (FIRE) Technologie. Diese Technologie wurde von Rutgers entwickelt und entwickelt. Die grundlegende Methode zur Beurteilung der biologischen Überlebensfähigkeit für die Photosynthese basiert auf der Messung und Analyse des Chlorophyll-Profils mit variabler Fluoreszenz, das eine Eigenschaft der Photosynthese-Agentur ist * (das wurde von Falkowski et al. 2005 überprüft). Die "variable Fluoreszenz"-Technologie basiert auf der Beziehung zwischen Chlorophyllfluoreszenz und der Prozesseffizienz der Photosynthese und bietet einen umfassenden Satz von Fluoreszenz- und Photosyntheseparametern für Organismen. Die optische Messung ist empfindlich, schnell und beschädigungsfrei und kann in Echtzeit und vor Ort durchgeführt werden.

Diese Methode und die implementierten instrumentalen Prinzipien wurden in der Peer-Review-Literatur etabliert (Falkowski and Kolber 1995; Kolber et al., 1998; Gorbunov et al., 2000, 2001; Gorbunov and Falkowski 2004). Ursprünglich zur Untersuchung des Planktons in Wassersäulen entwickelt, bietet die FRR-TechnologieGenauInformationen über das Funktionieren der planktonischen Gemeinschaften und die Auswirkungen von Umweltfaktoren, die die Primärproduktivität der Meere kontrollieren (z.B. Falkowski und Kolber 1995; Falkowski und Raven 2007; Behrenfeld et al., 1996; Coale et al., 2004; Falkowski et al., 2004). Die Verwendung von Desktop- und Tauchgeräten für FRR und FIRE-Fluoreszenz ist ein integraler Bestandteil der meisten Biooceanographieprojekte in den USA und weltweit.

F-Fluoreszenz-I-Induktion und R-Prep (FIRe)-Technologie entwickeltUm eine umfassende Reihe von photosynthetischen und physiologischen Merkmalen von fotosynthetischen Organismen zu messen (Gorbunov and Falkowski 2005). Die FIRe-Technik basiert auf der Aufzeichnung und Analyse von fluoreszierenden Transiten, die durch eine Reihe von angeregten Blitze verursacht werden, deren Intensität, Dauer und Intervalle genau kontrolliert werden (Abbildung 1 und Gorbunov and Falkowski 2005). Diese Technik bietet eine umfassende Reihe von Parametern, die sich durch den photosynthetischen Beleuchtungsprozess, die Photochemie im Photosystem II (PSII) und die photosynthetische Elektronenübertragung zur Kohlenstofffixierung auszeichnen. Da diese Prozesse besonders empfindlich auf Umweltfaktoren sind, bietet die FIRe-Technologie die Grundlage für die Identifizierung und Diagnose natürlicher (Nährstoffbeschränkungen, photochemische und Lichtstimulierung, thermischer Stress usw.) und menschlich verursachter Stressfaktoren wie Verschmutzung.

Abbildung 1.Beispiele von FIRe-Fluoreszenz-Momenten. Die Dynamik der Fluoreszenzgabe wird in Mikrosekunden-Zeitauflösung aufgezeichnet und umfasst vier Phasen: (einsStufe, 100 ms) Ein starker kurzer Impuls von 100 ms (bekannt als Single-Circuit-Flash, STF) wird für die kumulative Sättigung von PSII verwendet und die Fluoreszenzinduktion von Fo bis Fm (STF) gemessen: (Stufe 2, 500 ms) Schwach moduliertes Licht wird zur Aufzeichnung der Entspannungsdynamik der Fluoreszenzausgabe auf einer Zeitskala von 500 ms verwendet: (Stufe 3, 50 ms) Ein starker langer Impuls von 50 ms (bekannt als Multi-Circuit-Flash, MTF) wird für die Sättigung von PSII und PQ-Bibliotheken verwendet: (Stufe 4, 1 s) Schwach moduliertes Licht wird zur Aufzeichnung der Dynamik der Reoxidation der PQ-Bibliothek auf einer Zeitskala von 1 s verwendet. Phase 1 Analyse zur Verfügung gestellt: Minimum und bisgroßFluoreszenzproduktion (Fo, Fm); Quanteneffizienz Fv/Fm (STF) der photochemischen Ladungstrennung von PSII; Funktionale Querschnitte des PSII, σPSII; und den Verbindungsfaktor (p). Phase 2 liefert eine Zeitkonstante für die Elektronenübertragung des PSII-Empfängers (d. h. Qa-Rezeptorseitige Reoxidation). Phase 3 bietet Fm (MTF) und Fv/Fm (MTF). Phase 4 enthüllt die Elektronenübertragungszeitkonstante zwischen PSII und PSI (Reoxidation der PQ-Bibliothek).

Biophysikalischer Hintergrund der variablen Fluoreszenztechnologie- Bei Raumtemperatur wird Chlorophyllfluoreszenz hauptsächlich durch PSII erzeugt. Wenn das PSII-Reaktionszentrum geöffnet ist (Qa-Oxidation), ist die Fluoreszenzausgabe sehr gering, Fo. Wenn Qa reduziert wird (z. B. durch Exposition gegenüber starkem Licht), schließt sich das Reaktionszentrum und die Fluoreszenzausgabe steigt auf ihre hohen Werte Fm. Zur Detektion von Fo und Fm erfasst die FIRE-Technologie die Fluoreszenzinduktion, die durch starke gesättigte Impulse (~ 100 μs, bekannt als Single-Circuit-Flash, STF) verursacht wird (Abbildung 1 Phase 1). Die Fluoreszenzinduktivität ist proportional zum Querschnitt der funktionellen Absorption von PSII, während die relative Magnitude des Fluoreszenzstiegs Fv/Fm durch die Quanteneffizienz der PSII-Optochemie definiert wird. Die Form der fluoreszierenden Induktion wird durch die Übertragung der Erregungsmenge zwischen einzelnen Fotosyntheseeinheiten gesteuert und durch einen 'Verbindungsfaktor' definiert (Kolber et al. 1998). Daher ist die Fluoreszenzinduktion ohne Energieübertragung (p = 0) exponentiell und wird zur Gegenkurve, wenn p auf den maximalen Wert von ~0,5 bis 0,7 steigt.

Die kinetische Energie der PSII-Rezeptorseitigen Elektronenübertragung (d.h. Qa-Reoxidation) wurde durch eine Fluoreszenz-Predynamik-Analyse nach STF (Abbildung 1, Phase 2) bewertet. Die Fluoreszenzdynamik besteht aus mehreren Teilen, da die Reoxidationsgeschwindigkeit von Qa vom Zustand des zweiten Elektronenrezeptors Q b abhängt, der als beweglicher Doppelelektronenrezeptor funktioniert:

Qa-Qb → Qa Qb- (150 - 200 ms) (1)

Qa-Qb- → Qa Qb= (600 - 800 ms) (2)

Qa- _ → Qa-Qb → Qa Qb- (~ 2000 ms) (3)

Die Reaktion (3) entspricht den Bedingungen, wenn Qb ursprünglich von der D1-Protein-Bindungsstelle getrennt. Darüber hinaus kann ein kleiner Teil der Elektronenübertragung beschädigte Deaktivierungsreaktionszentren helfen, die langsamsten Komponenten in der Dynamik zu verhindern. Die FIRe-Software verarbeitet die Predynamik mit einer 3-Komponentenanalyse, um die Zeitkonstante der Elektronenübertragung (d. h. Q-Oxid tQa) abzurufen.

Die Zeitkonstante tPSII-PSI für die Elektronenübertragung zwischen PSII und PSI wurde aus einer Fluoreszenz-Prädynamikanalyse nach dem Multi-Circuit-Flash (MTF, Phasen 3 und 4 in Abbildung 1) gewonnen. Unter den meisten physiologischen Bedingungen wird diese Zeitkonstante durch die Reoxidationsgeschwindigkeit der Plasmaquinon-Bibliothek (PQ) bestimmt und ist eine Größenordnung langsamer als tQa.

Messung einer Reihe von Umgebungslichtintensiven FIRE-Fluoreszenzparametern, die die Geschwindigkeit der Elektronenübertragung durch die Photosynthese rekonstruieren können, Pf， Als Funktion der Lichtintensität (Photosynthese und Lichtintensitätskurve) (Kolber und Falkowski, 1993). Pf ist proportional zur photochemischen Quantenausgabe (DF'/Fm'), die unter Licht und Umgebungslicht gemessen wird. Die Analyse dieser Fotosynthese und Lichtintensitätskurven liefert eine große Elektronenübertragungsgeschwindigkeit (Pmax) und einen Lichtsättigungskoeffizienten (Ek) für die Fotosynthese. Die Fotosynthese- und Strahlenmessungen erfolgen unter Verwendung einer optischen Lichtquelle (ALS) von FIRe, die von einem Computer über die Datenerfassungssoftware FIRe gesteuert wird.

Forschungs- und Entwicklungshintergrund und FachwissenDie Mitglieder des Rutgers-Teams verfügen über mehr als 20 Jahre Erfahrung in der Entwicklung von variablen Fluoreszenztechnologien und Methoden. Sie haben Instrumente* für mehr als 10 biophysikalische Studien erfunden und entwickelt (siehe Anhang-Referenzliste für relevante Peer-reviewed-Publikationen).

2. Instrumenteinführung

Mini-FIRE basiert auf den gleichen biophysikalischen Prinzipien wie frühere Desktop-FIRE-Instrumente (Gorbunov and Falkowski 2005), aber das neue Instrument ist dreimal kompakter und zehnmal empfindlicher. Die untere Grenze der Chlorophyllkonzentration liegt bei ~0,005 mg/m3, was mini-FIRE für die Probenahme vor Ort auf offener See sehr wertvoll macht.

Hier schlägt das Rutgers-Team vor, ein Mini-FIRe (Abbildung 2) zu bauen, das für die diskrete Probenanalyse verwendet wird (z. B. Proben, die aus einer goldenen Flasche von Nice am Standort gesammelt wurden) und / oder für die kontinuierliche Probenahme im Ozean. Das Instrument wird mit einer durchströmenden Probenkammer ausgestattet, um kontinuierlich die Biomasse und die fotosynthetischen Eigenschaften des Planktons zu zeichnen. Im Folgenden finden Sie eine Liste der physiologischen Parameter der mini-FIRE-Aufzeichnung und die technischen Spezifikationen des Instruments mini-FIRE (Abbildung 2). Das Instrument wird für die Analyse diskreter Proben (z. B. Proben aus goldenen Flaschen von Nice am Standort) und / oder für die kontinuierliche Probenahme im Ozean verwendet. Das Instrument wird mit einer durchströmenden Probenkammer ausgestattet, um kontinuierlich die Biomasse und die fotosynthetischen Eigenschaften des Planktons zu zeichnen. Im Folgenden finden Sie eine Liste der physiologischen Parameter und technischen Spezifikationen der mini-FIRE-Aufzeichnung.

Abbildung 2 Mini-FIRe Fluoreszenz mit erhöhter Empfindlichkeit.

Messparameter:

Minimale und maximale Fluoreszenzproduktion nach Dunkelanpassung (Fo, Fm)

Effektive, minimale und maximale Fluoreszenzverleistung bei Lichtanpassung (F', Fo', Fm') *

● Optochemische bis hohe effektive Quantenentwicklung in Optik-Systemen II und PSII (Fv/Fm und DF'/F m))

Funktionale Absorptionsschnittsfläche PSII unter drei Wellenlängen (sPSII)

● Energieübertragungseffizienz zwischen Photosyntheseeinheiten ('Verbindungsfaktor')

PSII Rezeptorseitige Elektronenübertragungszeitkonstante (Q a bis Qb, Qa bis Qb-)

Elektronenübertragungszeitkonstante für die Photosynthese zwischen PSII und PSI

• Elektronische Übertragungsgeschwindigkeit, ETR， Als Funktion der Lichtstärke*

●Photochemischer Härtkoeffizient (qP) und Nicht-photochemischer Härtkoeffizient (NPQ) *

● bis zu hohen Fotosynthesgeschwindigkeiten, Anfangsneigungen und Umlaufzeiten für die Fotosynthese (aus den F- und E-Kurven)

Diese Parameter werden mit einer optischen Lichtquelle (ALS) gemessen und als Lichtintensitätskurve aufgezeichnet.

Technische Spezifikationen des mini-FIRe Systems:

Empfindlichkeit: 0,005 - 100 mg/m3 Chlorophyl a (die Probenkonzentration kann durch Hinzufügen eines neutralen Dichte-Reduktionsfilters erhöht werden)

● Stimulierende Lichtquelle: Blau (Spitzenwellenlänge 450 nm, 30 nm Bandbreite), Grün (Spitzenwellenlänge 530 nm, 40 nm Bandbreite), Orange (Spitzenwellenlänge 590 nm, 30 nm Bandbreite) zur selektiven Stimulation von Plankton verschiedener Funktionsgruppen.

Emissionsdetektion: 680 nm (Chlorophyl a) und 880 nm (Bakterienschlorophyl a), andere Wellenlängen können mit austauschbaren Emissionsfiltern ausgewählt werden.

● Größe: 10 x 5 x 12 Zoll